Quantification du NAD+ et de ses métabolites dans les nerfs sciatiques de souris
Introduction
Les parties cruciales du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et de ses métabolites dans le vieillissement et la neurodégénérescence ont été largement reconnues. Pour stimuler les progrès vers la recherche biochimique et les interventions ciblant le vieillissement et les maladies neurodégénératives, il est très important de quantifier avec précision le NAD+ et ses niveaux de métabolites dans la voie de récupération du NAD+. Ici, une méthode LC-MS/MS robuste et précise est appliquée pour quantifier les niveaux de NAD+ et de ses métabolites dans le nerf sciatique de souris normal et blessé.
Limites des méthodes existantes de quantification du NAD+ et de ses métabolites
Les méthodes traditionnelles de quantification du NAD+ et de ses métabolites, telles que la HPLC-UV, la RMN, l’électrophorèse de la zone capillaire ou les tests enzymatiques colorimétriques, sont confrontées à divers défis en matière de sensibilité, de sélectivité et de mesure indirecte. En ce qui concerne les dosages LC-MS/MS existants pour les mesures cellulaires ou tissulaires du NAD+ et de ses métabolites, il reste encore de nombreuses difficultés à surmonter, telles que des temps d’exécution prolongés, un mauvais comportement de rétention chromatographique et des formes de pics insatisfaisantes. De plus, seules une à trois substances de la voie de récupération du NAD+ peuvent être couvertes par ces méthodes.
Les modifications de la méthode LC-MS/MS
Sur la base des tests LC-MS/MS existants, les modifications concernant les conditions chromatographiques, la matrice de substitution et les conditions MS/MS sont effectuées. Plus précisément, 5 μM d’acide méthylène phosphonique sont utilisés comme additif de phase mobile, ce qui favorise explicitement l’intensité du signal et la forme du pic. Compte tenu de la nature relativement propre et simple des échantillons et de leur petite taille, l’eau ultrapure est testée comme matrice de substitution. Au lieu d’une colonne de chromatographie liquide à interaction hydrophile et d’une colonne hypercarb, la colonne Atlantis Premier BEH C18 AX de Waters est utilisée, dont la technologie de surface haute performance unique MaxPeak HPS (passivation de la paroi interne de la colonne, élimination de la surface métallique) permet la haute reproductibilité, la symétrie des pics et la séparation de base de tous les analytes.En outre, les conditions MS sont optimisées pour minimiser le signal d’interférence NAD+ dans le canal cyclique de l’adénosine diphosphate ribose (cADPR) tout en maintenant la réponse du cADPR et du nicotinamide mononucléotide (NMN), avec 4000V pour la tension de pulvérisation ionique, 450°C pour la température du turbochauffeur, 50 psi pour le gaz 1, 50 psi pour le gaz 2, 30 psi pour le gaz rideau et 12 psi pour le gaz de collision.
Chromatogramme représentatif d’échantillons de nerfs (normal vs blessé)
Les cinq analytes atteignent la séparation de base, où cADPR est un biomarqueur sensible dans le modèle de neurodégénérescence. Dans ce cas, l’axotomie du nerf sciatique induit une dégénérescence axonale, entraînant une réduction du niveau de NAD+ et une élévation du taux de NMN dans les nerfs lésés, entraînant une augmentation d’environ 2 fois du rapport NMN/NAD+. Simultanément, les niveaux de nicotinamide (NAM) et d’adénosine diphosphate ribose (ADPR) sont diminués d’environ 2 fois, tandis que le niveau de cADPR est augmenté de plus de 8 fois. Ces résultats sont cohérents avec ceux des recherches précédemment publiées, vérifiant l’exactitude de cette méthode LS-MS/MS modifiée dans la quantification du NAD+ et de ses métabolites.
Conclusion
Cette méthode LC-MS/MS modifiée permet une séparation de base efficace du NAD+, du NMN, du NAM, de l’ADPR et du cADPR en une courte durée de 5 minutes, ce qui contribue au diagnostic précoce de divers troubles neurologiques et au développement de médicaments pour le vieillissement et les maladies neurodégénératives.
Référence
Ma Y, Deng L, Du Z. Développement et validation d’une méthode LC-MS/MS pour quantifier le NAD+ et les métabolites associés dans les nerfs sciatiques de souris et son application à un modèle animal de lésions nerveuses. J Chromatogr A. doi :10.1016/j.chroma.2024.464821
BONTAC NAD
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Démenti
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