Ingénierie enzymatique couplée à la croissance par manipulation de la régénération des cofacteurs redox

Une gamme de plus en plus large de produits chimiques est maintenant produite à partir de matières premières renouvelables par des moyens biotechnologiques. Les bioprocédés dépendent fortement de la catalyse enzymatique pour la production efficace de ces composés. Garantir que les enzymes fonctionnent de manière optimale dans leur environnement requis est donc d'un grand intérêt pour une production durable.

Des propriétés telles que la spécificité de substrat, la vitesse catalytique et la (thermo)stabilité comptent parmi plusieurs facteurs critiques qui doivent être optimisés pour des bioprocédés enzymatiques efficaces. Cette optimisation peut être longue, coûteuse et difficile, et par conséquent, des moyens efficaces et rentables, probablement pour la sélection couplée à la croissance, d'ingénierie d'enzymes avec des caractéristiques souhaitables sont très recherchés.

Les avantages de l'utilisation de la sélection couplée à la croissance comme forme de sélection enzymatique, qui consiste à lier l'activité d'une enzyme à la croissance d'une cellule. Cette méthode peut être utilisée comme stratégie de sélection à haut débit, et peut être réalisée soit en garantissant que la croissance dépend de la synthèse du produit par l'enzyme cible, soit en liant l'activité de l'enzyme à l'état énergétique global de la cellule. La biologie synthétique peut être utilisée pour concevoir des souches adaptées à la sélection couplée à la croissance, et les progrès récents se sont concentrés sur la conception de souches déficientes en états oxydés ou réduits des paires de cofacteurs redox, qui peuvent servir de plateformes d'ingénierie enzymatique. L'utilisation de ces plateformes peut accélérer le développement de biocatalyseurs et de bioprocédés améliorés.

Avantages du couplage de croissance via l'auxotrophie en cofacteurs

Les avantages de l'utilisation de l'auxotrophie en cofacteurs comme méthode de sélection pour l'ingénierie d'enzymes impliquées dans la biosynthèse de certains produits chimiques, tels que les lipides, les biocarburants, les gaz, les solvants organiques ou les composés polymères. Cette approche offre plusieurs avantages uniques, notamment la capacité de sélectionner le produit souhaité indépendamment du substrat ou du produit d'intérêt, ce qui facilite la détection d'une activité enzymatique améliorée, et offre une lecture pour détecter une activité enzymatique améliorée. De plus, l'utilisation d'auxotrophes en cofacteurs comme plateformes de couplage de croissance est bénéfique car la nature omniprésente des cofacteurs redox dans le métabolisme microbien signifie que les stratégies d'ingénierie peuvent être transférables latéralement à d'autres microbes d'intérêt, et les enzymes peuvent être directement conçues dans l'environnement de l'hôte microbien souhaité. (illustré à la figure 1)

Figure 1 : Comparaison de plusieurs techniques de criblage/sélection largement utilisées pour l'ingénierie enzymatique

Mutants déficients en oxydation de NADH

L'oxydation du NADH chez E. coli peut se produire par deux voies, selon la disponibilité en oxygène. Dans des conditions aérobies, le NADH est principalement oxydé par respiration pour générer de l'ATP, tandis que dans des conditions anaérobies, il peut être oxydé par des voies de fermentation pour produire du lactate et de l'éthanol. Des souches mutantes d'E. coli, incapables d'utiliser les voies de fermentation mixtes pour l'oxydation du NADH pendant la croissance anaérobie, ont été utilisées pour piloter les voies d'oxydation du NADH pour la synthèse anaérobie de divers produits chimiques, tels que le 2-méthylpropan-1-ol, le 2,3-butanediol, le 1-butanol et la L-alanine. Ces souches mutantes ont également été utilisées pour concevoir des enzymes en exploitant des principes redox similaires, ce qui a donné des variantes améliorées. Les souches résultantes peuvent être utilisées pour concevoir d'autres enzymes et voies dépendantes de NAD(P)H.

Mutants déficients en réduction de NAD+

Wenk et al. ont créé une souche d'E. coli en supprimant le gène de la dihydrolipoyl déshydrogénase (lpd), ce qui a rendu la souche incapable de générer du pouvoir réducteur (NADH et NADPH) à partir du métabolisme de l'acétate en raison de l'absence d'activité pyruvate déshydrogénase. Cela a provoqué une auxotrophie pour le pouvoir réducteur lorsque la souche était cultivée en aérobie sur acétate comme seule source de carbone. (illustré à la figure 2) La souche a pu croître sur acétate lorsqu'elle était supplémentée avec des substrats glycolytiques supérieurs ou lorsqu'elle exprimait des déshydrogénases dépendantes de NAD+ pour le formiate, l'éthanol ou le méthanol avec leurs substrats respectifs. La souche n'a pas été utilisée pour l'ingénierie enzymatique et n'a été évaluée que pour l'auxotrophie en cofacteurs redox.
 

Figure 2 : Métabolisme central

Mutants déficients en oxydation de NADPH

Il existe deux stratégies différentes pour induire l'auxotrophie en NADP+ chez E. coli, reposant sur l'ingénierie de la voie glycolytique pour surproduire du NADPH. La première stratégie consiste à supprimer le gène natif gapA et à exprimer une enzyme GAPDH hétérologue dépendante de NADP+, tandis que la seconde stratégie consiste à rediriger le flux de carbone à travers la voie des pentoses phosphates. Les souches résultantes sont incapables de croître sur glucose mais présentent une croissance dans différentes conditions, la première souche étant cultivée dans des conditions anaérobies et la seconde dans des conditions aérobies avec du glycérol comme substrat. Ces souches sont utilisées pour concevoir des enzymes avec des propriétés améliorées, notamment la spécificité de substrat, l'activité catalytique et la thermostabilité.

Mutants déficients en réduction de NADP+

Trois bactéries différentes, E. coli, P. putida et C. glutamicum, ont été conçues pour être auxotrophes en NADPH, ce qui signifie qu'elles nécessitent du NADPH exogène pour leur croissance. Dans le cas d'E. coli et de C. glutamicum, des enzymes métaboliques centrales ont été inactivées pour éviter la réduction du NADP+ lorsque le glucose était fourni comme source de carbone, tandis que chez P. putida, l'ingénierie assistée par CRISPR/nCas9 a été utilisée pour perturber séquentiellement des ensembles de gènes cibles afin de comprendre leur implication dans le métabolisme redox. Les souches auxotrophes en NADPH ont ensuite été utilisées pour l'ingénierie enzymatique couplée à la croissance basée sur la spécificité des cofacteurs. Un seul cycle de mutagenèse utilisant E. coli a produit la déshydrogénase du formiate dépendante de NADP+ la plus efficace et la plus spécifique à ce jour, tandis que P. putida et C. glutamicum représentent les premières souches de leur espèce pouvant être utilisées pour ce type d'ingénierie.

Mutants déficients en réduction de NMN+

Un système de sélection à couplage de croissance a été développé pour lier le cycle des cofacteurs et la croissance, en se basant sur une déficience dans la réduction du NMN+. La souche E. coli SHuffle a été utilisée, laquelle porte des délétions dans deux gènes impliqués dans la production de glutathion réduit. Une glutathion réductase dépendante du NMNH a été développée par mutagenèse rationnelle pour lier le processus au cycle NMN+/NMNH, et une glucose déshydrogénase dépendante du NMN+ a été utilisée pour soutenir le cycle des cofacteurs NMN+/NMNH et donc la croissance. L'étude a également appliqué pour la première fois l'auxotrophie en cofacteurs redox non canoniques pour l'ingénierie enzymatique couplée à la croissance, ce qui a donné un variant de phosphite déshydrogénase thermostable avec une efficacité catalytique et une stabilité temporelle améliorées in vitro. Ce travail fournit une souche utile pour l'ingénierie enzymatique couplée à la croissance, dépendante du cycle NMN+/NMNH et auxotrophe pour l'état réduit d'un cofacteur redox non canonique.

Le potentiel du couplage de croissance via les cofacteurs redox s'est avéré être un outil puissant pour l'ingénierie des biocatalyseurs, en particulier dans le contexte de la bioproduction durable. Bien que des progrès considérables aient été réalisés dans la génération de souches auxotrophes en cofacteurs redox, la déclaration suggère qu'il reste encore plusieurs voies de recherche inexplorées. L'une d'elles implique l'ingénierie de souches auxotrophes en cofacteurs d'organismes autres que E. coli, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles possibilités pour l'ingénierie enzymatique couplée à la croissance.

Dans l'ensemble, cela suggère que l'utilisation du couplage de croissance basé sur les cofacteurs redox représente une opportunité majeure pour l'ingénierie de la biocatalyse, en particulier pour la production de produits qui ne peuvent pas satisfaire les exigences d'autres approches d'ingénierie enzymatique à haut débit. Cela souligne la nécessité de développer des biocatalyseurs plus polyvalents et efficaces pour la bioproduction durable et met en évidence l'importance de poursuivre les recherches dans ce domaine.


Référence : Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Ingénierie enzymatique couplée à la croissance par manipulation de la régénération des cofacteurs redox, Biotechnology Advances, 2023.