Ingénierie enzymatique couplée par croissance par manipulation de la régénération des cofacteurs redox

Une gamme de produits chimiques de plus en plus large est désormais produite à partir de matières premières renouvelables par des moyens biotechnologiques. Les bioprocédés reposent fortement sur la catalyse enzymatique pour la production efficace de ces composés. S’assurer que les enzymes fonctionnent de manière optimale dans leur environnement requis est donc d’un grand intérêt pour une production durable.

Des propriétés telles que la spécificité du substrat, la vitesse catalytique et la (thermo)stabilité font partie de plusieurs facteurs critiques qui doivent être optimisés pour des bioprocédés efficaces pilotés par les enzymes. Cette optimisation peut être chronophage, coûteuse et difficile, et donc des moyens efficaces et rentables pour la sélection couplée par croissance, les enzymes d’ingénierie aux caractéristiques souhaitables sont très recherchées.

Les avantages d’utiliser la sélection couplée par la croissance comme forme de sélection enzymatique, qui consiste à lier l’activité d’une enzyme à la croissance d’une cellule. Cette méthode peut être utilisée comme stratégie de sélection à haut débit, et peut être réalisée soit en garantissant que la croissance dépend de la synthèse du produit par l’enzyme cible, soit en liant l’activité de l’enzyme à l’état énergétique global de la cellule. La biologie synthétique peut être utilisée pour concevoir des souches adaptées à la sélection couplée par croissance, et les avancées récentes se sont concentrées sur l’ingénierie de souches déficientes dans les états oxydés ou réduits des paires de cofacteurs redox, qui peuvent servir de plateformes d’ingénierie enzymatique. L’utilisation de ces plateformes pourrait accélérer le développement de biocatalyseurs et de bioprocédés améliorés.

Avantages du couplage de croissance via l’auxotrophie des cofacteurs

Les avantages de l’utilisation de l’auxotrophie des cofacteurs comme méthode de sélection pour l’ingénierie des enzymes impliquées dans la biosynthèse de certains produits chimiques, tels que les lipides, les biocarburants, les gaz, les solvants organiques ou les composés polymériques. Cette approche offre plusieurs avantages uniques, notamment la possibilité de sélectionner le produit désiré indépendamment du substrat ou du produit d’intérêt, facilitant la détection d’une activité enzymatique améliorée, et offrant un affichage pour détecter une activité enzymatique améliorée. De plus, l’utilisation des auxotrophes cofacteurs comme plateformes de couplage de croissance est bénéfique car la nature omniprésente des cofacteurs redox dans le métabolisme microbien permet aux stratégies d’ingénierie d’être transférables latéralement à d’autres microbes d’intérêt, et que les enzymes peuvent être directement modifiées dans l’environnement de l’hôte microbien désiré. (illustré comme figure 1)

Figure 1 : Comparaison de plusieurs techniques de dépistage/sélection largement utilisées en ingénierie enzymatique

Mutants déficients dans l’oxydation du NADH

L’oxydation du NADH dans E. coli peut se produire par deux voies, selon la disponibilité en oxygène. En conditions aérobies, le NADH est principalement oxydé par la respiration pour générer de l’ATP, tandis qu’en conditions anaérobies, il peut être oxydé par des voies de fermentation pour produire du lactate et de l’éthanol. Les souches mutantes d’E. coli, incapables d’utiliser des voies de fermentation mixtes pour l’oxydation du NADH lors de la croissance anaérobie, ont été utilisées pour alimenter les voies oxydantes du NADH lors de la synthèse anaérobie de divers produits chimiques, tels que le 2-méthylpropane-1-ol, le 2,3-butanediol, le 1-butanol et la L-alanine. Ces souches mutantes ont également été utilisées pour congénier des enzymes en exploitant des principes redox similaires, ce qui a permis d’améliorer les variantes. Les souches résultantes peuvent être utilisées pour ingénier d’autres enzymes et voies dépendantes de la NAD(P)H.

Mutants déficients en réduction de NAD+  

Wenk et al. ont créé une souche d’E. coli en supprimant le gène dihydrolipoyl déshydrogénase (LPD), ce qui a empêché la souche de générer une puissance réductrice (NADH et NADPH) à partir du métabolisme de l’acétate en raison de l’absence d’activité pyruvate déshydrogénase. Cela faisait que la souche présentait une auxotrophie pour réduire la puissance lorsqu’elle était cultivée aérobie sur de l’acétate comme seule source de carbone. (illustré comme figure 2) La souche a pu croître sur acétate lorsqu’elle était complétée avec des substrats glycolytiques supérieurs ou lorsqu’elle exprimait des déhydrogénases dé-hydrogénases dépendant de NAD+, en forme de formate, d’éthanol ou de méthanol avec leurs substrats respectifs. La souche n’a pas été utilisée pour l’ingénierie enzymatique et n’a été évaluée que pour l’auxotrophie des cofacteurs redox.
 

Figure 2 : Métabolisme central 

Mutants déficients dans l’oxydation de NADPH

Il existe deux stratégies différentes pour induire l’auxotrophie de NADP+ chez E. coli, reposant sur l’ingénierie de la voie glycolytique pour surproduire de NADPH. La première stratégie consiste à supprimer le gène gapA natif et à exprimer une enzyme GAPDH hétérologue dépendante de NADP+, tandis que la seconde consiste à rediriger le flux de carbone via la voie du phosphate pentose. Les souches résultantes ne peuvent pas croître sur le glucose mais présentent une croissance dans différentes conditions, la première souche étant cultivée en conditions anaérobies et la seconde en conditions aérobies avec le glycérol comme substrat. Ces souches sont utilisées pour l’ingénierie d’enzymes aux propriétés améliorées, notamment la spécificité du substrat, l’activité catalytique et la thermostabilité.

Mutants déficients en réduction de NADP+

Trois bactéries différentes, E. coli, P. putida, et C. glutamicum, ont été modifiées pour être NADPH-auxotrophes, ce qui signifie qu’elles nécessitent un NADPH exogène pour leur croissance. Dans le cas d’E. coli et de C. glutamicum, les enzymes métaboliques centrales ont été éliminées pour éviter la réduction du NADP+ lorsque le glucose était fourni comme source de carbone, tandis que chez P. putida, l’ingénierie assistée par CRISPR/nCas9 a été utilisée pour perturber séquentiellement des ensembles de gènes cibles afin de comprendre leur implication dans le métabolisme redox. Les souches auxotrophiques NADPH ont ensuite été utilisées pour l’ingénierie enzymatique couplée par la croissance basée sur la spécificité des cofacteurs. Un seul cycle de mutagenèse utilisant E. coli a permis à ce jour la déhydrogénase formatée la plus efficace et spécifique de NADP+, tandis que P. putida et C. glutamicum représentent les premières souches de leur espèce pouvant être utilisées pour ce type d’ingénierie.

Mutants déficients en réduction NMN+

Un système de sélection couplé par la croissance a été développé pour relier le cycle des cofacteurs et la croissance, basé sur une carence dans la réduction du NMN+. La souche E. coli SHuffle a été utilisée, qui porte des délétions dans deux gènes impliqués dans la production de glutathion réduit. Une glutathion réductase dépendante de NMNH a été développée par mutagenèse rationnelle pour relier ce processus au cycle NMN+/NMNH, et une glucose déshydrogénase dépendante de NMN+ a été utilisée pour soutenir le cycle des cofacteurs NMN+/NMNH et donc la croissance. L’étude a également appliqué pour la première fois l’auxotrophie des cofacteurs redox non canonique pour l’ingénierie enzymatique couplée croissance, aboutissant à une variante thermostable de phosphite déshydrogénase avec une efficacité catalytique et une stabilité temporelle améliorées in vitro. Ce travail fournit une déformation utile pour l’ingénierie enzymatique couplée croissance, dépendant du cycle NMN+/NMNH et ausophique pour l’état réduit d’un cofacteur redox non canonique.

Le potentiel du couplage de croissance via les cofacteurs redox a servi d’outil puissant pour concevoir des biocatalyseurs, notamment dans le contexte de la bioproduction durable. Bien que des progrès considérables aient été réalisés dans la génération de souches auxotrophes cofacteurs redox, la déclaration suggère qu’il existe encore plusieurs voies de recherche inexplorées. L’une d’elles consiste à ingénier des souches auxotrophes cofacteurs d’organismes autres qu’E. coli, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles possibilités pour l’ingénierie enzymatique couplée par croissance.

Dans l’ensemble, cela suggère que l’utilisation du couplage croissance-basé sur des cofacteurs redox représente une opportunité majeure pour l’ingénierie de la biocatalyse, en particulier pour la production de produits qui ne peuvent pas satisfaire aux exigences d’autres approches d’ingénierie enzymatique à haut débit. Il souligne la nécessité de développer des biocatalyseurs plus polyvalents et efficaces pour une bioproduction durable et souligne l’importance de poursuivre la recherche dans ce domaine.


Référence : Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Ingénierie enzymatique couplée par la croissance par manipulation de la régénération des cofacteurs redox, Biotechnology Advances, 2023.