L’optimisation des conditions de réaction pour obtenir un rendement élevé de stévia rebaudioside D
Les régimes riches en sucre ont conduit à une prévalence croissante de diverses maladies chroniques, notamment l’obésité, le diabète, les maladies cardiovasculaires et l’hypertension, posant un problème majeur de santé publique mondiale. Stevia Rebaudioside D (Reb D), un édulcorant naturel issu de plantes, a attiré une attention importante en tant que substitut de sucre en raison de sa teneur en calories, de sa douceur intense et de son profil gustatif agréable.
Cependant, sa présence limitée dans la stevia rebaudiana Bertoni et les difficultés liées à la faible solubilité et à l’activité enzymatique de la glycosyltransférase d’origine végétale ont freiné son application commerciale généralisée. En réponse à ces problèmes, une nouvelle glycosyltransférase appelée YojK, issue de Bacillus subtilis 168, a été découverte. Cette étude introduit une glycosyltransférase bactérienne génétiquement modifiée, YojK-I241T/G327N, caractérisée par une grande solubilité et une efficacité catalytique élevées, offrant un grand potentiel pour la production industrielle de Reb D.
Le développement d’une méthode hautement efficace pour la production de rebaudioside D utilisant une réaction en cascade des enzymes YojK-I241T/G327N et AtSuSy.
Pour résoudre la question de la faible solubilité dans les glycosyltransférases d’origine végétale, les chercheurs ont étudié le potentiel d’utiliser YojK, une O-glycosyltransférase issue de Bacillus subtilis 168. YojK a été choisi en raison de son activité de glycosylation démontrée avec divers substrats, y compris de grosses molécules. Après une expression recombinante réussie et une purification, YojK a été utilisé pour glycosylater Reb A, ce qui a conduit à la production de Stevia Reb D. L’analyse cinétique enzymatique a révélé que YojK a une activité catalytique plus faible envers Reb D que d’autres glycosyltransférases. Par conséquent, l’étude suggère la nécessité d’une ingénierie guidée par la structure pour améliorer l’activité catalytique de YojK à des fins pratiques potentielles. (comme montré à la Figure 1)
Figure 1
L’optimisation des conditions de réaction pour obtenir un rendement élevé de rebaudioside D.
Les conditions de réaction, incluant le pH, la température et la concentration du substrat, peuvent être optimisées pour obtenir un rendement élevé de Srevia Reb D. L’étude a utilisé des simulations de dynamique moléculaire pour étudier comment la variante YojK-I241T/G327N améliore la glycosylation de Reb D. La variante a maintenu une liaison hydrogène stable entre Reb A et H14 lors des simulations, contrairement au type sauvage (comme montré à la Figure 2). Cette stabilité s’étendait également à la distance entre l’atome d’O2 de Reb A et le C1P de l’UDPG. L’efficacité catalytique améliorée de la variante YojK-I241T/G327N a été attribuée à ces interactions stables, suggérant son potentiel pratique.
Figure 2
Figure 3
Conclusion
Cette approche a donné 83,47 % de Reb D. Notamment, l’ajout de 1 mM d’UDPG a permis la synthèse de 20,59 g/L de Reb D avec un rendement remarquable de 91,29 %, dépassant les études précédentes. Ce procédé démontre le potentiel de la production industrielle de Reb D, notamment après l’ingénierie structurelle de YojK.YojK peut être exprimé efficacement dans E. coli BL21 (DE3) avec une solubilité élevée. Grâce à une ingénierie guidée par structure, un double mutant, YojK-I241T/G327N, a été créé, permettant la production à grande échelle de Reb D avec un rendement exceptionnel de 91,29 % grâce au recyclage de l’UDPG catalysé par la sacchrose synthase AtSuSy. Cette étude présente YojK-I241T/G327N comme un outil prometteur pour une production industrielle de Reb D à grande échelle économiquement efficace.
