L'optimisation des conditions de réaction pour obtenir un rendement élevé de stévia rébaudioside D
Les régimes riches en sucre ont entraîné une prévalence croissante de diverses maladies chroniques, notamment l'obésité, le diabète, les maladies cardiovasculaires et l'hypertension, posant un problème majeur de santé publique mondiale. Le rébaudioside D de stévia (Reb D), un édulcorant naturel dérivé de plantes, a suscité une attention considérable en tant que substitut du sucre en raison de son apport calorique nul, de son intensité sucrante élevée et de son profil gustatif agréable.
Cependant, sa présence limitée dans Stevia rebaudiana Bertoni et les défis liés à la faible solubilité et à l'activité enzymatique des glycosyltransférases d'origine végétale ont entravé son application commerciale à grande échelle. En réponse à ces problèmes, une nouvelle glycosyltransférase appelée YojK, issue de Bacillus subtilis 168, a été découverte. Cette étude présente une glycosyltransférase bactérienne génétiquement modifiée, YojK-I241T/G327N, caractérisée par une solubilité et une efficacité catalytique élevées, offrant un grand potentiel pour la production industrielle de Reb D.
Le développement d'une méthode très efficace pour la production de rébaudioside D en utilisant une réaction en cascade des enzymes YojK-I241T/G327N et AtSuSy.
To address the issue of low solubility in plant-derived glycosyltransferases, researchers investigated the potential of using YojK, an O-glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168. YojK was chosen because of its demonstrated glycosylation activity with various substrates, including large molecules. After successful recombinant expression and purification, YojK was employed to glycosylate Reb A, resulting in the production of Stevia Reb D. Enzyme kinetic analysis revealed that YojK has lower catalytic activity toward Reb D compared to other glycosyltransferases. Consequently, the study suggests the necessity for structure-guided engineering to enhance YojK's catalytic activity for potential practical applications. (as shown in Figure 1)
Figure 1
L'optimisation des conditions de réaction pour obtenir un rendement élevé de rébaudioside D.
The reaction conditions, including pH, temperature, and substrate concentration, can be optimized to achieve a high yield of Srevia Reb D. The study used molecular dynamics simulations to investigate how the YojK-I241T/G327N variant enhances Reb D glycosylation. The variant maintained a stable hydrogen bond between Reb A and H14 during simulations, unlike the wild-type(as shown in Figure 2). This stability also extended to the distance between Reb A's O2 atom and UDPG's C1P. The YojK-I241T/G327N variant's improved catalytic efficiency was attributed to these stable interactions, suggesting its practical potential.
Figure 2
Figure 3
Conclusion
Cette approche a produit 83,47 % de Reb D. Notamment, l'ajout de 1 mM d'UDPG a permis la synthèse de 20,59 g/L de Reb D avec un rendement remarquable de 91,29 %, surpassant les études précédentes. Ce processus démontre le potentiel de production industrielle de Reb D, en particulier après l'ingénierie structurelle de YojK.YojK peut être exprimé efficacement dans E. coli BL21 (DE3) avec une solubilité élevée. Grâce à une ingénierie guidée par la structure, un double mutant, YojK-I241T/G327N, a été créé, permettant la production à grande échelle de Reb D avec un rendement exceptionnel de 91,29 % en recyclant l'UDPG catalysé par la saccharose synthase AtSuSy. Cette étude présente YojK-I241T/G327N comme un outil prometteur pour une production industrielle de Reb D économiquement efficace.
