Quantification du NAD+ et de ses métabolites dans les nerfs sciatiques de la souris
Introduction
Les parties cruciales de la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et de ses métabolites dans le vieillissement et la neurodégénérescence ont été largement reconnues. Pour stimuler les progrès vers la recherche biochimique et les interventions ciblant le vieillissement et les maladies neurodégénératives, il est d’une grande importance de quantifier avec précision le NAD+ et ses niveaux de métabolites dans la voie de sauvetage du NAD+. Ici, une méthode LC-MS/MS robuste et précise est appliquée pour quantifier NAD+ et ses niveaux de métabolites dans le nerf sciatique normal et blessé de la souris.Limites des méthodes existantes pour quantifier NAD+ et ses métabolites
Les méthodes traditionnelles pour quantifier le NAD+ et ses métabolites, telles que le HPLC-UV, NMR, l’électrophorèse en zone capillaire ou les tests enzymatiques colorimétriques, rencontrent divers défis en matière de sensibilité, de sélectivité et de mesure indirecte. Quant aux tests existants de LC-MS/MS pour les mesures de NAD+ cellulaire ou tissulaire et de ses métabolites, de nombreuses difficultés restent à surmonter, telles que des temps d’exécution prolongés, un mauvais comportement de rétention chromatographique et des formes de pic insatisfaisantes. De plus, seulement une à trois substances de la voie de sauvetage NAD+ peuvent être couvertes par ces méthodes.Les modifications de la méthode LC-MS/MS
Sur la base des tests existants LC-MS/MS, les modifications concernant les conditions chromatographiques, la matrice de substitution et les conditions MS/MS sont réalisées. Plus précisément, 5 μM d’acide phosphonique méthylène est utilisé comme additif de phase mobile, ce qui favorise explicitement l’intensité du signal et la forme du pic. Étant donné la nature relativement propre et simple des échantillons never et leur petite taille, l’eau ultrapure est testée comme matrice de substitution. Au lieu de colonnes de chromatographie liquide à interaction hydrophile et colonne hypercarb, la colonne Waters Atlantis Premier BEH C18 AX est utilisée, dont la technologie unique MaxPeak HPS haute performance de surface (passivation de la paroi interne de la colonne, élimination de la surface métallique) permet une haute reproductibilité, une symétrie de pic et une séparation de base de tous les analytes. De plus, les conditions de la SEP sont optimisées pour minimiser le signal d’interférence NAD+ dans le canal cyclique de ribose d’adénosine diphosphate (cADPR) tout en maintenant la réponse du cADPR et du mononucléotide de nicotinamide (NMN), avec 4000V pour la tension de pulvérisation ionique, 450°C pour la température du turbo-chauffeur, 50 psi pour le gaz 1, 50 psi pour le gaz 2, 30 psi pour le gaz rideau et 12 psi pour le gaz de collision.
Chromatogramme représentatif des échantillons nerveux (normaux vs blessés)
Les cinq analytes atteignent la séparation de base, où cADPR est un biomarqueur sensible dans le modèle de neurodégénérescence. Ici, l’axotomie du nerf sciatique induit une dégénérescence axonale, entraînant une diminution du niveau de NAD+ et une élévation du niveau NMN dans les nerfs blessés, ce qui entraîne une augmentation d’environ deux fois le rapport NMN/NAD+. Simultanément, les niveaux de nicotinamide (NAM) et d’adénosine diphosphate ribose (ADPR) sont réduits d’environ 2 fois, tandis que le taux de cADPR est multiplié par plus de 8. Ces résultats sont cohérents avec ceux des recherches précédemment rapportées, vérifiant la précision de cette méthode LS-MS/MS modifiée pour quantifier NAD+ et ses métabolites.
Conclusion
Cette méthode modifiée de LC-MS/MS permet une séparation de base efficace de NAD+, NMN, NAM, ADPR et cADPR en un court temps d’exécution de 5 minutes, ce qui contribue au diagnostic précoce de divers troubles neurologiques et au développement de médicaments pour le vieillissement et les maladies neurodégénératives.Référence
Ma Y, Deng L, Du Z. Développement et validation d’une méthode LC-MS/MS pour quantifier le NAD+ et les métabolites apparentés chez les nerfs sciatiques de souris et son application à un modèle animal de lésions nerveuses. J Chromatogr A. doi :10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACse consacre depuis 2012 à la R&D, à la fabrication et à la vente de matières premières pour la coenzyme et les produits naturels, avec des usines indépendantes, plus de 170 brevets mondiaux ainsi qu’une équipe de R&D solide. BONTAC possède une riche expérience en R&D et une technologie avancée dans la biosynthèse deNAD et ses prédécesseurs(par exemple, NMN et NR). Il existe différents types de NAD à sélectionner, incluant NAD Grade ER (élimination de l’endoxine), NAD Grade I (IVD/compléments alimentaires/poudre brute cosmétique), NAD Grade II (API/intermédiaires) et NAD Grade IV (si les besoins en solubilité sont plus élevés), qui peuvent être fournis sous forme de poudre lyophilisée ou de poudre cristalline. La pureté du NAD BONTAC peut dépasser 98 %.
