Quantification du NAD+ et de ses métabolites dans les nerfs sciatiques de souris
Introduction
Les rôles cruciaux du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et de ses métabolites dans le vieillissement et la neurodégénérescence ont été largement reconnus. Pour stimuler les progrès vers la recherche biochimique et les interventions ciblant le vieillissement et les maladies neurodégénératives, il est d'une grande importance de quantifier avec précision les niveaux de NAD+ et de ses métabolites dans la voie de sauvetage du NAD+. Ici, une méthode LC-MS/MS robuste et précise est appliquée pour quantifier les niveaux de NAD+ et de ses métabolites dans le nerf sciatique de souris normales et lésées.Limitations des méthodes existantes pour quantifier le NAD+ et ses métabolites
Les méthodes traditionnelles pour quantifier le NAD+ et ses métabolites, telles que la HPLC-UV, la RMN, l'électrophorèse capillaire de zone ou les dosages enzymatiques colorimétriques, rencontrent divers défis en termes de sensibilité, de sélectivité et de mesure indirecte. Quant aux dosages LC-MS/MS existants pour les mesures du NAD+ et de ses métabolites dans les cellules ou les tissus, il reste encore de nombreuses difficultés à surmonter, telles que des temps d'analyse prolongés, un mauvais comportement de rétention chromatographique et des formes de pics insatisfaisantes. De plus, ces méthodes ne peuvent couvrir qu'une à trois substances dans la voie de sauvetage du NAD+.Les modifications de la méthode LC-MS/MS
Sur la base des dosages LC-MS/MS existants, des modifications concernant les conditions chromatographiques, la matrice de substitution et les conditions MS/MS sont effectuées. Plus précisément, 5 μM d'acide méthylène phosphonique est utilisé comme additif de phase mobile, ce qui favorise explicitement l'intensité du signal et la forme des pics. Étant donné la nature relativement propre et simple des échantillons de nerfs et leur petite taille, l'eau ultrapure est testée comme matrice de substitution. Au lieu de la colonne de chromatographie à interaction hydrophile et de la colonne hypercarb, la colonne Waters Atlantis Premier BEH C18 AX est utilisée, dont la technologie unique de surface haute performance MaxPeak HPS (passivant la paroi interne de la colonne, éliminant la surface métallique) permet une haute reproductibilité, une symétrie des pics et une séparation de base de tous les analytes.De plus, les conditions MS sont optimisées pour minimiser le signal d'interférence du NAD+ dans le canal du ribose cyclique adénosine diphosphate (cADPR) tout en maintenant la réponse du cADPR et du nicotinamide mononucléotide (NMN), avec 4000 V pour la tension de pulvérisation ionique, 450 ℃ pour la température du turbo chauffeur, 50 psi pour le gaz 1, 50 psi pour le gaz 2, 30 psi pour le gaz rideau et 12 psi pour le gaz de collision.
Chromatogramme représentatif des échantillons de nerfs (normaux vs lésés)
Tous les cinq analytes atteignent une séparation de base, où le cADPR est un biomarqueur sensible dans le modèle de neurodégénérescence. Ici, l'axotomie du nerf sciatique induit une dégénérescence axonale, entraînant une réduction du niveau de NAD+ et une élévation du niveau de NMN dans les nerfs lésés, résultant en une augmentation d'environ 2 fois du rapport NMN/NAD+. Simultanément, les niveaux de nicotinamide (NAM) et d'adénosine diphosphate ribose (ADPR) diminuent d'environ 2 fois, tandis que le niveau de cADPR augmente de plus de 8 fois. Ces résultats sont cohérents avec ceux des recherches précédemment rapportées, vérifiant la précision de cette méthode LC-MS/MS modifiée pour quantifier le NAD+ et ses métabolites.
Conclusion
Cette méthode LC-MS/MS modifiée permet une séparation de base efficace du NAD+, du NMN, du NAM, de l'ADPR et du cADPR en un temps d'analyse court de 5 minutes, ce qui contribue aux diagnostics précoces de divers troubles neurologiques et au développement de médicaments pour le vieillissement et les maladies neurodégénératives.Référence
Ma Y, Deng L, Du Z. Développement et validation d'une méthode LC-MS/MS pour quantifier le NAD+ et les métabolites associés dans les nerfs sciatiques de souris et son application à un modèle animal de lésion nerveuse. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACse consacre à la R&D, à la fabrication et à la vente de matières premières pour coenzymes et produits naturels depuis 2012, avec des usines en propre, plus de 170 brevets mondiaux ainsi qu'une solide équipe de R&D. BONTAC possède une riche expérience en R&D et une technologie avancée dans la biosynthèse deNAD et ses précurseurs(par exemple, NMN et NR). Il existe différents types de NAD à choisir, comprenant NAD Grade ER (élimination des endotoxines), NAD Grade I (poudre brute pour IVD/complément alimentaire/cosmétique), NAD Grade II (API/intermédiaires) et NAD Grade IV (si une exigence plus élevée sur la solubilité), qui peuvent être fournis sous forme de poudre lyophilisée ou de poudre cristalline. La pureté du NAD BONTAC peut atteindre plus de 98%.
